Izolace kmenových buněk

Zdroje pro izolaci kmenových buněk

Kmenové buňky lze izolovat z různých tkání. S vysokou výtěžností je možné je extrahovat z embryonálních tkání, neboť nezralé tkáně obsahují poměrně velké množství nediferencovaných (kmenových) buněk. V embryu navíc existují různé populace kmenových buněk, které vykazují hierarchické uspořádání. To znamená, že z vyvíjejícího se organismu mohou být izolovány různé typy kmenových buněk, které souhrnně patří do skupiny embryonálních kmenových buněk. Tyto kmenové buňky se podařilo izolovat z moruly, blastocysty, placenty, amniové tekutiny, základů vyvíjejících se orgánů (např. embryonálního mozku) a z pupečníkové krve. V úzkém slova smyslu je však pojem embryonální kmenové (ES) buňky rezervován pro buňky izolované z embryoblastu blastocysty. Historicky byly první ES izolovány z myší (v r. 1981); lidské se podařilo získat až v roce 1998. Následně byly pluripotentní ES kultivovány přes Hayflickův limit a to bez změny jejich fenotypu i genotypu. Díky tomu lze ES distribuovat z jedné laboratoře do druhé a využívat je jako zdroj pro in vitro produkci všech typů buněk lidského těla nebo k produkci chimérických zvířat.

Kmenové buňky po narození z těla nevymizí. Zůstávají zde jakoby zředěny mezi diferencovanými buňkami a své vlastnosti pak mění v závislosti na změně niché a podle potřeb organismu. Tkáňově specifické kmenové buňky je možné izolovat z různých tkání a v různých časových obdobích: z tkání dětí a dospělých, tkání starých lidí a dokonce i posmrtně. Z pohledu terapeutických aplikací se nejvíce zvažuje využití dospělých kmenových buněk. Kmenové buňky se rovněž vyskytují v nádorech, kde jsou zodpovědné za jejich růst.

Metody izolace kmenových buněk

Existují rozdílné přístupy pro izolaci kmenových buněk. Výběr metody izolace pak závisí na zdroji a typu buněk a také na věku dárce buněk. Řada metod využívá spíše než přímé izolace kmenových buněk pouze jejich obohacení v buněčné suspenzi eliminací nechtěných diferencovaných buněk. Toho lze dosáhnout například pomocí protilátek proti specifickým markerům diferencovaných buněk, které následně odseparujeme pomocí feromagnetických nanočástic (imunomagnetická separace). Další možností je lýza diferencovaných buněk pomocí faktorů komplementu. Podobného účinku je možno dosáhnout rovněž tak, že buněčné suspenzi odejmeme faktory, které podporují přežívání diferencovaných buněk, případně zvolíme takové kultivační nádobky, jejichž povrch neumožňuje adhezi buněk. Tyto metody jsou pak často kombinovány s postupy zaměřenými na stimulaci proliferace kmenových buněk (např. pomocí mitogenních růstových faktorů), čímž se kmenové buňky udrží při kultivaci v nediferencovaném stavu.

Buněčné kultury umožňují propagaci kmenových buněk i jejich expanzi in vitro (při stimulaci růstovými faktory kmenové buňky vstupují do symetrického dělení a jejich počty se zvyšují). Jelikož buňky neustále proliferují, brzy zcela pokryjí povrch kultivační nádoby. Dlouhodobé kultivace buněk lze dosáhnout pasážováním, kdy se buňky přesadí do nové kultivační nádobky, jakmile pokryjí její dno ze 70%.

Protože některé specifické markery kmenových buněk se již podařilo identifikovat, je možné využít k izolaci těchto buněk odpovídajících protilátek např. při metodě FACS (fluorescence–activated cell sorting – třídění buněk pomocí fluorescence). K izolaci kmenových buněk lze také použít jejich speciálních fyzikálních vlastností jako například velkého nukleocytoplazmatického poměru (poměru velikosti buněčného jádra vůči cytoplazmě) a obohatit suspenzi kmenových buněk při gradientové centrifugaci v separátorech. Zajímavým přístupem, jak separovat frakci kmenových buněk jako vedlejší populaci (side population – SP buňky), je využití jejich schopnosti vylučovat barvivo Hoechst. Zcela novou metodou je pak transfekce cílové buňky geny kódujícími pluripotentní transkripční faktory, která slouží k produkci tzv. indukovaných pluripotentních kmenových buněk (iPS).